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        外泌体系列

         外泌体(Exosome)由细胞产生,是直径介于30-150 nm的磷脂膜分泌性囊泡,广泛存在并分布在各种体液中(如血清、血浆、唾液、尿液)和细胞培养液等。目前的主流观点认为,外泌体的产生先是由细胞膜内陷,形成早期内小体(Early endosome),成熟晚期内小体(Late endosome)的膜向内萌发形成腔内小泡(intraluminal vesicles,ILV)并转化为多泡体(multivesicular bodies,MVB)。在MVB与质膜融合后,ILV被释放到细胞外形成外泌体(Exosome)。外泌体中携带有母细胞的多种蛋白质、脂类、DNARNA等生物活性分子,参与机体多种生理和病理过程。


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        外泌体形成过程[1]



        外泌体的发展历程


         目前,已有越来越多的学者开始关注外泌体在肿瘤发生和发展中的作用及其机制,外泌体将在癌症的诊断及治疗等领域发挥重要作用。有关外泌体的研究,主要集中在外泌体颗粒的提取、纯化和内容物分析上。



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        外泌体的作用


        1. 作为药物的载体进行药物靶向治疗

         RNA药物治疗是一项极具潜力的治疗手段,但是由于难以掌握RNA药物递送的稳定性和特异性,它的应用难度也随之增加。利用外泌体进行RNA的传递则可以解决这个问题。例如:将加载融合RVG肽的Lamp2b蛋白的外泌体静脉注射至小鼠体内,检测发现其特异性的敲降了小鼠体内BACE1(阿尔茨海默病的治疗靶点)的表达[2]

        2. 作为细胞间的信号分子,用于细胞交流

         外泌体作为细胞间的信号分子,在细胞间的信息传递中发挥着重要作用。例如:MPC(肌源性祖细胞)分泌含有miR-206的外泌体,来抑制成纤维细胞中Rrbp1(胶原蛋白合成的主要调节剂)的产生,从而防止过多的胶原蛋白在ECM(细胞外基质)沉积,以稳定组织状态[3]。外泌体miR-155中miRNA可以调节下游细胞对胰岛素的敏感性[4]

        3. 调节细胞内分子水平,从而调节细胞活性

         外泌体不仅可以作为细胞间信号调节的载体,也可以主动运载细胞内各种成分,进而调节细胞活性。例如:当MLKL被RIPK3磷酸化以后,磷酸化的MLKL会引起细胞的死亡,然而MLKL产生的外泌体可将磷酸化MLKL装入囊泡,并分泌到细胞外,使细胞免受死亡[5]

        4. 作为分子诊断的Marker,用于疾病的诊断

         相比于传统活检,液态活检取样方便、对机体损伤小。存在于体液和细胞培养液的外泌体因其特异性和相对稳定性,在作为疾病诊断的Biomaker方面具有很大的潜力。例如:前列腺癌基因3(Prostate Cancer Associated 3,PCA3)、跨膜丝氨酸蛋白酶2 (Transmembrane Serine Proteases 2,TTSPs 2)和ETS 相关基因(ETS-related gene,ERG)融合基因在PCa患者尿液外泌体中表达,尿液外泌体具有作为PCa诊断的的潜力[6]。Raimomlo等对比了肾癌患者尿液中检测到的186个蛋白,发现其中10个蛋白的表达有明显差异,肾癌患者显著高表达MMP9、DKK4和CAIX,且与肿瘤进展密切相关,提示它们有望成为潜在的分子标志物,为肾癌诊断和治疗提供有价值的临床信息[7]



        外泌体的提取方法


         目前外泌体常见的提取方法包括超速离心法、密度梯度离心、聚合物沉降法和特异性抗体捕获等方法。

        1. 超速离心法

        优点:方法简单,适合大剂量的样品处理。

        缺点:操作繁琐,费时费力,离心力可能导致外泌体结构破坏,对设备要求高。

        2. 密度梯度离心法

        优点:纯度相对较高,适合大剂量的样品处理。

        缺点:操作繁琐,费时费力,对设备要求高。

        3. 聚合物沉降法

        优点:操作简单,不需要超速离心机,得到的外泌体数量较多,适合大剂量的样品处理。

        缺点:杂质含量会比较多,尤其是一些杂蛋白。    

        4. 分子排阻法

        优点:纯度相对较高,且外泌体结构不易受到破坏。

        缺点:大小相近的颗粒也会被纯化出来,比如乳糜微粒、低密度脂蛋白等。

        5. 超滤法

        优点:操作方便,富集效率比较高,成本较低。

        缺点:外泌体易损耗变形,导致膜堵塞,纯度较低,大颗粒蛋白污染严重,附着于膜上的外泌体难以回收,导致提取损失。

        6. 磁珠特异性捕获法

        优点:外泌体纯度较高,并且对外泌体膜结构影响较小。

        缺点:成本较高,无法进行大剂量的提取,磁珠保存难度比较高。

         目前外泌体提取方法,普遍存在回收率低,纯度低,操作繁琐,结构不完整等问题。针对上述问题,北京全式金生物技术有限公司开发了一系列外泌体提取新产品,可从血清、血浆、细胞上清和尿液中提取外泌体,适用于下游的电镜分析、NTA分析、纳米流式(NanoFCM)分析、Western Blot、荧光定量(qPCR)等应用。

        TransExoTM Serum/Plasma Exosome Kit

        针对从血清、血浆中外泌体提取、纯化的产品,所得外泌体具有高纯度、高活性的优点,可以用于Western Blot、透射电镜、qPCR等多种检测方式。

        ●  操作简单,无需超速离心,只需将血清/血浆与提取试剂简单混合,即可有效分离外泌体。

        ●  增加微球纯化步骤,纯度高,活性高,可以用于多种检测方式。

        ●  血浆样品无需蛋白酶额外处理。


        粒径检测

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        使用 TransGen 和 Company S 产品提取外泌体,粒径结果显示 TransGen 产品提取的外泌体粒径范围和 Comapny S 产品基本一致。



        电镜检测

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        TransGen 产品 (+ 微球 ) 纯化得到的外泌体结构完整,杂质少,电镜背景更加清晰。


        微球纯化效果

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        使用TransGen和Company S产品提取外泌体,考马斯亮蓝染色结果显示

        TransGen产品所得到的外泌体的杂质蛋白更少,背景干扰小。


        外泌体标志性蛋白检测

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        使用 TransGen 产品提取外泌体,WB 检测结果显示

        可成功检测到外泌体的标志蛋白 CD63、CD81 和 CD9。


        外泌体活性检测

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        文献 (Harris et al., 2015) 显示 MDA-MB-231 细胞对自身分泌的外泌体敏感,在加入从该细胞上清中提取出来的外泌体后,细胞迁移速度发生明显改变。通过划痕实验证明在 MDA-MB-231 细胞中,加入 TransGen 产品所提取的外泌体后,细胞迁移率随着加入外泌体的含量增加而提高,说明所分离得到的外泌体具有活性,与文献描述一致。


        TransExoTM Cell Media Exosome Kit

         针对细胞上清中外泌体提取、纯化的产品,所得的外泌体具有高纯度、高活性的优点,可以用于Western Blot、透射电镜、qPCR、粒径等多种检测方式。

          操作简单,无须超速离心。

          样本需求量少,灵敏度高。

         

        电镜检测

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        使用TransGen和Company Q产品提取MDA-MB-231和Hela细胞上清中外泌体,

        电镜检测结果显示均可检测到结构完整的外泌体。


        外泌体标志性蛋白检测

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        MDA-MB-231 细胞分别进行饥饿诱导处理和无血清培养基培养,使用 TransGen 产品和 Company Q 产品提取细胞上清中的外泌体,WB 检测结果显示均可检测到外泌体的标志蛋白 TSG101、CD63、CD81。



        外泌体RNA检测

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        使用 TransGen 和 Company Q 产品成功提取外泌体后进行 total RNA 提取,反转录后定量检测miRNA (miR-92a)、lncRNA (RN7SL)、mRNA (MTND4) 表达。结果显示均可检测到三种 RNA 表达。


        适用于多种细胞上清外泌体提取

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        TransGen 产品提取不同种类细胞上清中的外泌体,WB 检测结果显示均可检测到

        外泌体的标志蛋白 TSG101。


        TransExoTM Urine Exosome Kit

         针对尿液中外泌体提取、纯化的产品,所得的外泌体具有高纯度、高活性的优点,可以用于Western Blot、透射电镜、qPCR、粒径等多种检测方式。

          操作简单,无须超速离心。

          样本需求量少,灵敏度高。



        粒径检测

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        使用 TransGen 和 Company Q 产品提取尿液中的外泌体,粒径检测结果显示

        TransGen 产品提取的外泌体粒径范围和 Company Q 产品基本一致。


        电镜检测

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        使用TransGen和Company Q产品提取尿液中的外泌体,

        电镜检测结果显示均可检测到结构完整的外泌体。


        外泌体标志性蛋白检测

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        使用 TransGen 和 Company Q 产品提取尿液中的外泌体,WB 检测结果显示

        均可检测到外泌体的标志蛋白 TSG101、CD81、CD9。


        外泌体 RNA 检测

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        使用 TransGen 和 Company Q 产品成功提取外泌体后进行 total RNA 提取,反转录后定量检测miRNA (miR-10b-5p)、lncRNA (RN7SL)、mRNA (MTND4) 表达。结果显示均可检测到三种 RNA 表达。


         外泌体是由细胞分泌的膜性小囊泡,携带着细胞来源的蛋白质、脂质、DNA和RNA等分子。这些物质作为细胞间的信号分子,用于细胞间交流。开展外泌体中RNA研究,有助于深入了解外泌体的作用。北京全式金生物技术有限公司开发了针对血清/血浆中外泌体RNA提取新产品,可提取血清/血浆中外泌体中的总RNA。

        TransExoTM Serum/Plasma Exosome Total RNA Extraction Kit

        针对血清/血浆外泌体中总RNA提取的产品,具有操作简便、快速、提取量高的优点,提取的RNA适用于qPCR等多种检测方式。

          操作简单,无需超速离心。

          提取量大,纯度高,适用于多种检测。


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        用TransGen和Company S产品提取外泌体总RNA,反转录后定量检测miRNA(miR-486)、mRNA(MTND4)、lncRNA(RN7SL)的表达,结果显示TransGen产品优于Company S产品。



        外泌体相关产品推荐

        http://www.ly815.com/exosomes.html


        参考文献

        [1] Roles of Exosomes in Ocular Diseases.

        [2] Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes.

        [3] Myogenic Progenitor Cells Control Extracellular Matrix Production by Fibroblasts during Skeletal Muscle Hypertrophy.

        [4] Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.

        [5] MLKL,the Protein that Mediates Necroptosis, Also Regulates Endosomal Trafficking and Extracellular Vesicle    Generation.

        [6] Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer.

        [7] Differential protein profiling of renal cell carcinoma urinary exosomes.


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